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Bio-techne|做好 ELISA 的小細節,搖床你用對了嗎?

在 ELISA 實驗所需的簡單儀器中,搖床是個迷惑的存在,科研猿們經常在是否需要使用中舉棋不定。大多數的 ELISA 實驗是不需要使用搖床的,室溫孵育即可,但有些特殊的 ELISA 不但需要搖床,且有嚴格的使用參數。

在 R&D Systems® ELISA 試劑盒說明書中,其實早有答案,以 Human IL-6 Quantikine HS ELISA Kit(貨號 HS600C)為例,操作流程(Assay procedure)部分中提到:

這里,建議使用 500 rpm,0.12" orbit 參數的搖床/振蕩器。

 

  • 搖床長什么樣?為什么需要使用搖床?

眾所周知,實驗室里通常有各種用途及規格的搖床,如用來培養細菌、動物細胞及用于 Western Blot 抗體孵育的搖床等。

我們 ELISA 說明書中要求的搖床類似下圖,該搖床專為 96 孔板設計,軌道直徑 3 mm,轉速可達到 500±50 rpm,運行時快速振動,且頂部托盤有微孔板固定裝置,微孔板既不會松脫,也不會有液體飛濺。

 

 

如果在 ELISA 產品說明書中要求使用搖床,則必須使用,否則會影響抗原抗體的有效結合,導致待測孔的 OD 值偏低。

例如使用 Human/Mouse/Rat Activin A Quantikine ELISA Kit(貨號 DAC00B),在未使用搖床時得到的標準品 OD 值(450 nm 的測定值減去 570 nm 的測定值)異常(表 1)。

結果顯示,最高濃度(1,000 pg/mL)的標準品平均 OD 值僅為 0.647,且 125pg/mL 標準品兩個復孔 OD 值相差較大,低濃度標準品 OD 值無明顯梯度。因而無法保證檢測結果的準確性。而在使用了搖床的實驗中,標準品 OD 值正常(表 2)。

 

  • 是否必須使用指定參數的搖床?可以用其它規格代替嗎?

由于說明書中指定的軌道直徑 3 mm,轉速 500±50 rpm 的搖床是我們驗證過的能保證準確結果的搖床,而其它搖床,如 Western Blot 實驗中使用的水平搖床軌道直徑較大,如果設置成 500rpm 就會轉速太快,容易造成微孔板內液體飛濺、樣品孔污染,進而影響實驗結果的準確性。

 

如果您希望使用其它規格的搖床嘗試,可進行如下操作:

將適量體積的液體加入備用 96 孔微孔板,用封口膜覆蓋孔板;

調整搖床速度,讓液體劇烈振蕩,使其幾乎旋轉到微孔板的頂部,但不能形成氣泡或飛濺到封板膜上;

使用 R&D Systems® 的試劑盒做一次標準曲線,驗證一下實驗結果是否可以接受。

 

但這種測試需要耗費額外的孔板及時間,得不償失,所以最好還是根據說明書的建議選擇搖床。

小小的搖床,卻關乎實驗的成敗。當我們準備開展實驗時,不妨多研讀一番說明書,不要錯過其中的細枝末節。

 

以上文字和圖片來源于Bio-techne

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